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ELISA-Peptide Assay プロトコール (ELISA-P)

#6967 Phospho-PKC Substrate Motif [(R/K)XpSX(R/K)] MultiMab™ Rabbit mAb mix用プロトコール

A. 溶液および試薬

  1. 炭酸バッファー: 15 mM Na2CO3、35 mM NaHCO3、0.2 g/L NaN3 (pH 9.6)。炭酸バッファーに合成ペプチド1 μMを加えたものを使用してください。
  2. 20×PBS: (#9808) 1×PBSを1 L用意する場合は、20×PBS 50 mLを精製水950 mLに加えて混ぜ合わせてください。
  3. 洗浄バッファー: 0.05% Tween® 20含有1×PBS (PBST) (#9809)
  4. ブロッキングバッファー: 10 mg/mLウシ血清アルブミン (BSA) 含有PBST
  5. 抗体希釈液: 3% BSA含有PBST
  6. マウス一次抗体用DELFIA®ユーロピウム標識抗マウスIgGもしくはラビット一次抗体用DELFIA®ユーロピウム標識抗ラビットIgG: (PerkinElmer Life Sciences社製、#AD0124)
  7. DELFIA® Enhancement溶液: (PerkinElmer Life Sciences社製、#1244-105)

B. プロトコール

  1. 96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに1 μM合成ペプチド含有炭酸バッファー100 μLを加え、4℃で一晩もしくは37℃で2-6時間インキュベートし、プレートにペプチドを固相化してください。ペプチドが結合あるいは吸着しない場合は、pH 4-8の他のバッファーで試してください。
  2. 各ウェルを洗浄バッファー200 μLで3回洗浄してください。
  3. 各ウェルにブロッキングバッファー200 μLを加え、37℃で1時間ブロッキングしてください。プレートを洗浄バッファーで3回洗浄してください (必要に応じて、乾燥プレートを4℃で1-2ヵ月保存することも可能です)。
  4. 抗体希釈バッファーで一次抗体を適宜希釈し、各ウェルに100 μLを加え、37℃で1時間インキュベートしてください。
  5. 洗浄バッファーで3回洗浄してください。
  6. 各ウェルに予め67 ng/100 μLになるように抗体希釈バッファーで希釈したDELFIA®ユーロピウム標識抗マウスIgGあるいは抗ラビットIgG 100 μLを加え、緩やかに振盪しながら37℃で30分間インキュベートしてください。
  7. 洗浄バッファーで5回洗浄してください。
  8. Enhancement溶液100 μLを加え、室温で5分間インキュベートしてください。適切な時間分解プレートリーダーで615 nmの吸光度を測定してください。

posted June 2005

revised September 2007

protocol id: 34

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