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ウェスタンブロッティング (Western Blotting) プロトコール

#3777 Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (D7A5) XP® Rabbit mAb用プロトコール

最適な結果を得るために、5% w/v BSA、1×TBS、0.1% Tween® 20で希釈した一次抗体と転写膜を緩やかに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。

注意: 推奨の一次抗体希釈率は、各製品のデータシートあるいはWebの製品ページを参照してください。

A. 溶液および試薬

注意: 溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20×PBS: (#9808) 1×PBSを1 L用意する場合は、20×PBS 50 mLを精製水950 mLに加えてください。
  2. 10×TBS: (#12498) 1×TBSを1 L用意する場合は、10×TBS 100 mLを精製水900 mLに加えてください。
  3. 1×SDSサンプルバッファー: Blue Loading Pack (#7722) もしくはRed Loading Pack (#7723) 3×SDS泳動バッファーに1/10容量の30×DTTを加え、新しい3×還元用泳動バッファーを用意してください。精製水で1×に希釈してください。
  4. 10×トリス-グリシンSDS泳動バッファー: (#4050) 1×泳動バッファーを1 L用意する場合は、10×泳動バッファー100 mLを精製水900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  5. 10×トリス-グリシン転写バッファー: (#12539) 1×転写バッファーを1 L用意する場合は、10×転写バッファー100 mLをメタノール200 mLと精製水700 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  6. 10×TBST: (#9997) 1×TBSTを1 L用意する場合は、10×TBST 100 mLを精製水900 mLに加えてください。
  7. 脱脂粉乳: (#9999).
  8. ブロッキングバッファー: 5% w/v脱脂粉乳含有1×TBST; 150 mL用意する場合は、脱脂粉乳7.5 gを1×TBST 150 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  9. 洗浄バッファー: (#9997) 1×TBST.
  10. ウシ血清アルブミン (BSA)
  11. 一次抗体希釈バッファー: 5% BSA含有1×TBST; 20 mL用意する場合は、BSA 1.0 gを1×TBST 20 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  12. ビオチン化プロテインラダー: (#7727).
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa): (#13953).
  14. 転写膜: (#12369) このプロトコールは、CSTが推奨しているニトロセルロース膜用です。ポアサイズは、0.2 μmをお薦めしています。
  15. HRP標識二次抗体: Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074).
  16. 検出試薬: SignalFire™ ECL Reagent (#6883).

B. 電気泳動および転写

一般的なサンプル調製は、下記プロトコールを参照してください。

  1. 調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
  2. 培地を吸引除去し、1×PBSで細胞を洗浄後、再度、上清を吸引除去してください。
  3. 1×SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートの場合は100 μL/ウェル、直径10 cmのプレートの場合は500 μL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞をこすり落とし、遠心用チューブに移して氷上に置いてください。
  4. 細胞を完全に溶解するため、また、DNAをせん断しサンプルの粘性を下げるために10-15秒間超音波処理してください。
  5. サンプル20 μLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷冷してください。
  6. 5分間遠心してください。
  7. SDS-PAGEゲル (10 cm×10 cm) に20 μLアプライし、電気泳動してください。

    注意: CSTは、転写確認用のPrestained molecular weight markers (#13953, 10 μL/lane) および分子量測定用のBiotinylated protein ladder (#7727, 10 μL/lane) も同時に電気泳動することをお薦めしています。

  8. ニトロセルロース膜 (#12369) に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意: 10 cm×10 cm (100 cm2) の転写膜用の容量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜容量を調整してください。

I. 転写膜のブロッキング

  1. オプション: 転写後、必要に応じてTBS 25 mLでニトロセルロース膜を室温で5分間洗浄してください。
  2. ブロッキングバッファー25 mL中で転写膜を室温で1時間インキュベートしてください。
  3. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。

II. 一次抗体反応

  1. 一次抗体希釈バッファーで製品のデータシートで推奨する適切な希釈率に希釈した一次抗体10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  3. HRP標識anti-rabbit IgG二次抗体 (#7074 1:2,000) とビオチン化プロテインマーカー検出用HRP標識anti-biotin抗体 (#7075 1:1,000–1:3,000) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  5. 検出操作Dに進んでください。

D. 検出

使用法:

  1. HRP (抗体に標識) が結合している転写膜をTBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  2. 1×SignalFire™ ECL Reagent (#6883) を調製し (2×Reagent A 5 mL、2×Reagent B 5 mL)、よく混ぜます。
  3. 1×SignalFire™ ECL Reagent 10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、室温で1分間インキュベートした後、転写膜の余分な液を除去し (乾燥させないでください)、ラップで包んでX線フィルムに露光してください。

* 皮膚への暴露は避けてください。

posted June 2005

revised November 2013

protocol id: 10

ウェスタンブロッティング リプロービング プロトコール

限られた量のサンプルしか入手できない場合、既存の転写膜をリプロービングすることは、複数のタンパク質を1枚で別々にイムノブロッティングするために有効な手段です。ただし、最良な結果を得るためには、新たにブロットした転写膜の使用が推奨されていることに留意してください。リプロービングは有用な方法ではありますが、回数を重ねるとバックグラウンドが高くなる可能性があります。加えて、リプロービング後のシグナルがリプロービング前の最初の抗体によるシグナルではないことを確認する必要があります。そのために、リプロービング前の抗体複合体が除去されていることを確認してください。この行程は、リプローブとして次の抗体を加える前に、ECL試薬に再暴露させて、シグナルが検出されないことで確認できます。

A. 溶液および試薬

注意: 溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 洗浄バッファー: 1×TBS、0.1% Tween® 20 (TBST-10×) (#9997)
  2. ストリッピングバッファー: 100 mL用意する場合は、1M Tris-HCl (pH 6.8) 6.25 mLと20% SDS 10 mL、β-mercaptoethanol 700 μLを混ぜ合わせてください。精製水を加えて全量を100 mLにしてください。使用直前に調製し、新鮮なバッファーを用意してください。

B. プロトコール

  1. フィルム露光後、TBSTで転写膜を各5分間、4回洗浄してください。転写膜が乾燥していない場合に最良の結果が得られます。
  2. 転写膜をストリッピングバッファーと軽く振盪しながら50℃で30分間インキュベートしてください。
  3. TBSTで転写膜を各5分間、6回洗浄してください。
  4. オプション: ノイズを抑えるために、必要に応じてTBST 10 mLで転写膜を各5分間、2回洗浄してください。転写膜を調製した1×SignalFire™ ECL Reagentと緩やかに振盪しながら室温で1分間インキュベートしてください。転写膜の余分な液を除去してください。乾燥させないでください。ラップで包み、X線フィルムに露光してください。
  5. 再度TBSTで転写膜を各5分間、4回洗浄してください。
  6. これで転写膜の再利用が可能です。ウェスタンブロッティングプロトコールの「転写膜のブロッキングと抗体反応」ステップに従い、検出を行ってください。

posted June 2005

テクニカルサポート

Pathways & Diagrams for Epigenetic Regulation