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免疫蛍光染色 (細胞化学染色) プロトコール (IF-IC)

#2478 Phospho-VEGF Receptor 2 (Tyr1175) (19A10) Rabbit mAb用プロトコール

A. 溶液および試薬

注意: 溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20×PBS: (9808) 1×PBSを1 L用意する場合は、20×PBS 50 mLを精製水950 mLに加えて混ぜ合わせてください。pH 8.0に調整してください。
  2. 16%ホルムアルデヒド: (メタノール不含、Polysciences社製、Cat#18814)。新しいホルムアルデヒドを使用してください。開封後は、暗所、4℃で保存してください。4%ホルムアルデヒドは1×PBSで4倍に希釈して調製してください。
  3. ブロッキングバッファー: (1×PBS/5%正常血清/0.3% Triton™ X-100) 10 mL用意する場合は、二次抗体と同種の正常血清 (例、正常ヤギ血清) 0.5 mLを1×PBS 9.5 mLに加えてよく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton™ X-100 30 μLを加えてください。
  4. 抗体希釈バッファー: (1×PBS/1% BSA/0.3% Triton™ X-100) 10 mL用意する場合は、Triton™ X-100 30 μLを1×PBS 10 mLに加えてよく混ぜ合わせてから、BSA 0.1 gを加えてよく混ぜ合わせてください。
  5. 推奨蛍光標識二次抗体:

  6. ProLong® Gold Antifade Reagent (#9071)、あるいはDAPI入りProlong® Gold AntiFade Reagent (#8961)。

B. 試料作製 - 培養細胞株 (IF-IC)

注意: マルチウェルプレート、チャンバースライドあるいはカバーガラス上で直接細胞を培養、処理、固定および染色してください。

  1. 溶液を吸引除去し、1×PBSで希釈した4%ホルムアルデヒドを細胞が2-3 mm浸る程加えてください。

    注意: ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフトチャンバー内でのみ使用してください。

  2. 細胞を室温で15分間固定してください。
  3. 固定液を吸引除去し、1×PBSで各5分間、3回すすいでください。
  4. 免疫染色操作Cに進んでください。

C. 免疫染色

注意: 乾燥と蛍光色素退色の防止のため、遮光湿潤箱中、または蓋付きのディッシュ/プレート中で行うように指定がない限り、免疫染色の全てのインキュベーションは室温で行ってください。

  1. ブロッキングバッファーで試料を60分間ブロッキングしてください。
  2. ブロッキングしている間に、一次抗体を抗体希釈バッファーで、データシートに記載の通りに希釈してください。
  3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体をアプライしてください。
  4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  5. 1×PBSで各5分間、3回すすいでください。
  6. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体と、暗室、室温で1-2時間インキュベートしてください。
  7. 1×PBSで各5分間、3回すすいでください。
  8. スライドにProlong® Gold Antifade Reagent (#9071) あるいはDAPI入り (#8961) を添加し、カバーガラスで覆ってください。
  9. 最良の結果を得るために、封入剤を室温で一晩硬化させてください。スライドを長期保存する際は、4℃、暗所で、フラットに保存してください。

posted November 2006

revised November 2013

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