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クロマチン免疫沈降法

#5326 Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) (D1A9) XP® Rabbit mAb用プロトコール

試薬

SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005に含まれる試薬:

  1. グリシン溶液 (10×、100 mL)
  2. バッファーA (4×、25 mL)
  3. バッファーB (4×、25 mL)
  4. ChIPバッファー (10×、20 mL)
  5. ChIP溶出バッファー (2×、7 mL)
  6. 5 M NaCl (3 mL)
  7. 0.5 M EDTA #7011
  8. ChIP-Grade Protein G磁気ビーズ #9006
  9. DNA Binding Buffer (30 mL)
  10. DNA Wash Buffer (6 mL、使用前に4倍量のエタノールを加えてください)
  11. DNA Elution Buffer (1 mL x 2)
  12. DNAスピンカラム (36 Pack)
  13. プロテアーゼ阻害剤カクテル (PIC) (200×、750 μL x 2)
  14. RNase A (10 mg/mL、50 μL)
  15. Micrococcal Nuclease (60 μL) #10011
  16. Proteinase K (20 mg/mL、100 μL)
  17. SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers #7014
  18. SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers #7015
  19. Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620
  20. Normal Rabbit IgG #2729
  21. DTT (Dithiothreitol)(192.8 mg) #7016

SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004に含まれない試薬:

  1. Magnetic Separation Rack #7017 / #14654
  2. PBS (1X) #9872
  3. Nuclease Free Water #12931
  4. エタノール (96-100%)
  5. ホルムアルデヒド (37%ストック)
  6. Taq DNAポリメラーゼ
  7. dNTPミックス

I. 組織クロスリンク、サンプル調製:

組織採取の際、サンプルから脂肪や壊死物質などの不要な物質を除去してください。その後、組織はすぐにクロスリンクできます。または、ドライアイスで凍結保存することも可能です。最適なクロマチン産生量とChIP結果を得るために、免疫沈降1回当たり組織25 mgを使用してください。クロマチンの産生量は組織タイプによって異なりますので、組織によっては25 mg以上が必要になる場合があります。様々な組織タイプで予想されるクロマチン産生量については、Appendix Aを参照してください。クロマチンの断片化と濃度の分析 (Section IV) 用にもクロマチンサンプルを用意してください。

実験開始前の準備:

  • 200×PICと10×グリシン溶液を室温に戻してください。PICが完全に溶けていることを確認してください。
  • 組織25 mgにつきPBS + 200×PIC 15 μLの混合液を3 mL用意し、氷上に置いてください。
  • 組織25 mgにつき37%ホルムアルデヒド45 μLを用意し、室温に置いてください。有効期限内の新しいホルムアルデヒドを用いてください。

A. クロスリンク

  1. 新鮮組織または凍結組織サンプルを計量し、免疫沈降1回当たり25 mgの組織を使用してください。
  2. 組織サンプルを60 mmか100 mmのプレートに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。その際、タンパク質の分解を防ぐために、常にプレートを氷上に置いてください。
  3. 刻んだ組織を15 mLコニカルチューブに移してください。
  4. 組織25 mgにつきPBS + PIC混合液1 mLをコニカルチューブに加えてください。
  5. PBS + PIC混合液1 mLにつき37%ホルムアルデヒド45 μLを加え、室温で穏やかに振盪しながら20分間インキュベートし、タンパク質とDNAをクロスリンクさせてください。ホルムアルデヒドの最終濃度は1.5%です。
  6. PBS + PIC混合液1 mLにつき10×グリシン溶液100 μLを加え、室温で5分間振盪し、クロスリンクを停止してください。
  7. 1,500 rpm、4℃で5分間遠心してください。
  8. 上清を除去し、組織25 mgにつきPBS + PIC混合液1 mLで1回洗浄してください。
  9. 再度、1,500 rpm、4℃で5分間遠心してください。
  10. 上清を除去し、組織をPBS + PIC混合液1 mL (組織25 mg当たり) に再懸濁し、氷上に置いてください。Medimachine (Part B) あるいはDounce Homogenizer (Part C) を用いて、組織を単細胞懸濁液に分離してください。

B. Medimachine (BD Biosciences: part #340587) を用いた組織分離

  1. 1,000 μLピペットチップの先を切って、穴を広げ、組織の塊が通るようにしてください。
  2. PBS + PIC混合液に再懸濁した組織1 mLを、50 mm Medicone (part #340592) の一番上のチャンバーに移してください。
  3. メーカーの推奨に従い、組織を2分間すり潰してください。
  4. 1 mL注射器と18ゲージの先の鈍い針を用いて、Mediconeの一番下のチャンバーから細胞懸濁液を集めてください。細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、氷上に置いてください。
  5. 均質な懸濁液になるまで、ステップ2.から4.を繰り返してください。
  6. 更にすり潰しが必要な場合、組織にPBS + PIC混合液を追加してください。均質な懸濁液になるまで、ステップ2.から5.を繰り返してください。
  7. 顕微鏡で単細胞懸濁液であることを確認してください (オプション)。
  8. 1,500 rpm、4℃で5分間遠心してください。
  9. 上清を除去し、直ちにSection III (細胞核の調製、クロマチンの断片化) に進んでください。

C. Dounce Homogenizerを用いた組織分離

  1. PBS + PIC混合液に再懸濁した組織をDounce Homogenizerに移してください。
  2. 20-25回ストロークし、組織を破砕してください。顕微鏡で単細胞懸濁液であることを確認してください (オプション)。
  3. 細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、1,500 rpm、4℃で5分間遠心してください。
  4. 上清を除去し、直ちにSection III (細胞核の調製、クロマチンの断片化) に進んでください。

II. 培養細胞クロスリンク、サンプル調製:

最適なChIPの結果を得るために、免疫沈降1回当たり約4×106個の細胞を使用してください。この細胞数は、HeLa細胞の場合、増殖培地20 mLに密集度90%の細胞を含む15 cmのプレートの半分に相当します。これ以外に、クロマチンの断片化と濃度の分析 (Section IV) 用にもクロマチンサンプルを用意してください。また、血球計を用いて細胞数を測定するため、プレートを別途1枚用意してください。

実験開始前の準備:

  • 200×PICと10×グリシン溶液を室温に戻してください。PICが完全に溶けていることを確認してください。
  • 15 cmのプレート1枚につきPBS + 200×PIC 10 μLの混合液を2 mL用意し、氷上に置いてください。
  • 15 cmのプレート1枚につきPBS 40 mLを用意し、氷上に置いてください。
  • 15 cmのプレート1枚につき37%ホルムアルデヒド540 μLを用意し、室温に置いてください。有効期限内の新しいホルムアルデヒドを用いてください。
  1. 培地20 mLを含む直径15 cmの各プレートに、37%ホルムアルデヒド540 μLを加え、室温で穏やかに振盪しながら10分間インキュベートし、タンパク質とDNAをクロスリンクさせてください。ホルムアルデヒドの最終濃度は1%です。ホルムアルデヒドの添加により、培地の色が変化する場合があります。
  2. 培地20 mLを含む直径15 cmの各プレートに10×グリシン溶液2 mLを加え、室温で穏やかに振盪しながら5分間インキュベートしてください。グリシンの添加により、培地の色が変化する場合があります。
  3. 浮遊細胞は、50 mLコニカルチューブに移し、1,500 rpm、4℃で5分間遠心してください。氷冷したPBS 20 mLで沈殿物を2回洗浄してください。上清を除去し、直ちにSection III (細胞核の調製、クロマチンの断片化) に進んでください。
  4. 接着細胞は、培地を除去し、氷冷したPBS 20 mLで細胞を2回洗浄してください。その際、毎回プレートから洗浄液を完全に除去してください。
  5. 各15 cmプレートに氷冷したPBS + PIC混合液2 mLを加えてください。冷えたバッファーの中に細胞をこすり落としてください。すべてのプレートの細胞を、15 mLコニカルチューブに合わせ入れてください。
  6. 1,500 rpm、4℃で5分間遠心してください。上清を除去し、直ちにSection III (細胞核の調製、クロマチンの断片化) に進んでください。

III. 細胞核の調製、クロマチンの断片化:

1回分の免疫沈降調製液 (IP prep) とは、25 mgの分離組織または4×106個の組織培養細胞とします。

実験開始前の準備:

  • 200×PICを室温に戻し、完全に溶けていることを確認してください。
  • DTT #7016 192.8 mgにdH2O 1.12mLを加えて1 M DTTを調製してください。 DTT結晶が完全に溶解していることを確認してください。重要: 一度溶液にした1 M DTTは、-20°Cで保存してください。
  • 10×ChIPバッファーを室温に戻してください。SDSが完全に溶解していることを確認してください。
  • IP prepにつき1×バッファーA 1 mL (4×バッファーA 250 μL + 水750 μL) + 1 M DTT 0.5 μL + 200×PIC 5 μL混合液を用意し、氷上に置いてください。
  • IP prepにつき1×バッファーB 1.1 mL (4×バッファーB 275 μL + 水825 μL) + 1 M DTT 0.55 μL混合液を用意し、氷上に置いてください。
  • IP prepにつき1×ChIPバッファー100 μL (10×ChIPバッファー10 μL + 水90 μL) + 200×PIC 0.5 μL混合液を用意し、氷上に置いてください。
  1. 細胞を氷冷した1×バッファーA + DTT + PIC混合液1 mL (IP prep当たり) に再懸濁し、氷上で10分間インキュベートしてください。3分毎に転倒混合してください。
  2. 3,000 rpm、4℃で5分間遠心し、細胞核を沈澱させてください。上清を除去し、沈殿物を氷冷した1×バッファーB + DTT混合液1 mL (IP prep当たり) に再懸濁してください。再度、遠心し、上清を除去し、沈殿物を1×バッファーB + DTT混合液100 μL (IP prep当たり) に再懸濁してください。サンプルを1.5 mL遠心用チューブに移してください (チューブに最大1 mLまで)。
  3. IP prepにつきMicrococcal Nuclease #10011 0.5 μLを加え、チューブを数回転倒混合してください。頻繁に撹拌しながら、37℃で20分間インキュベートし、DNAを約150-900 bpに断片化してください。3分から5分おきに転倒混合してください。DNAを最適な長さに断片化するために要するMicrococcal Nucleaseの量は、組織や細胞株毎に実験的な決定が必要な場合があります (Appendix B参照)。HeLa細胞核は4×106個の細胞につき、マウスの肝組織は25 mgにつきMicrococcal Nuclease 0.5 μLで断片化すると、適切なDNAの長さとなります。
  4. IP prepにつき0.5 M EDTA #7011 10 μLを加えてDNAの断片化を終了し、チューブを氷上に置いてください。
  5. 13,000 rpm、4℃で1分間遠心し、細胞核を沈澱させ、上清を除去してください。
  6. 1×ChIPバッファー + PIC混合液100 μL (IP prep当たり) に細胞核ペレットを再懸濁し、氷上で10分間インキュベートしてください。
  7. 1.5 mL遠心用チューブ当たり最大500 μLの溶解物を数回超音波処理し、核膜を破砕してください。超音波処理の合間は、サンプルを氷上で30秒間インキュベートしてください。細胞核を完全に溶解するための最適条件は、超音波処理の前後に光学顕微鏡でサンプルを観察することで決定できます。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicatorを6に設定し (1/8-inch probe)、20秒間の超音波処理を3回行うことで、HeLa細胞核は完全に溶解されます。Dounce Homogenizerで20回処理を行っても細胞核は溶解されますが、完全な溶解でない可能性があります。
  8. 10,000 rpm、4℃で10分間遠心し、溶解物を浄化してください。
  9. 上清の可溶性クロマチン分画を新しいチューブに移してください。これが、クロスリンクされたクロマチン調製液です。クロマチンの断片化と濃度の分析 (Section IV) 用に、50 μLを取り分けてください。残りのクロマチン調製液は、使用するまで-80℃で保存してください。

IV. クロマチンの断片化と濃度の分析 (推奨ステップ):

  1. Section IIIのステップ9.で取り分けた50 μLのクロマチンサンプルに、nuclease-free water #12931 100 μL、5 M NaCl 6 μL、RNase A 2 μLを加え、ボルテックスして、37℃で30分間インキュベートしてください。
  2. RNase Aで処理したサンプルに、Proteinase K 2 μLを加えてください。ボルテックスして、65℃で2時間インキュベートしてください。
  3. Section VIIを参照して、スピンカラムを用いてサンプルのDNAを精製してください。
  4. DNA精製後、100 bp DNAマーカーとともに、サンプル10 μLを1%アガロースゲルで電気泳動し、DNAフラグメントサイズを測定してください。DNAは、約150-900 bp (ヌクレオソーム1-6個) の長さに断片化されているはずです。
  5. DNA濃度を測定するために、精製したDNA 2 μLをnuclease-free water 98 μLに加えて50倍希釈し、OD260を測定してください。DNA濃度 (μg/mL) は、OD260 ×2,500の値となります。DNA濃度が50-200 μg/mLになることが理想です。

注意: 最適なChIPの結果を得るためには、クロマチンのサイズと濃度が非常に重要となります。断片化が進みすぎると定量PCRのシグナルが減少し、断片化が不十分だとバックグラウンドシグナルが増加し、解像度が低下します。また、免疫沈降に加えるクロマチンが少量であっても、定量PCRのシグナルが減少します。クロマチン断片化の最適化については、Appendix Bのプロトコールを参照してください。

V. クロマチン免疫沈降:

最適なChIPの結果を得るために、1回の免疫沈降当たり約5-10 μgのクロスリンク、断片化されたクロマチン (Section IVにて濃度決定) を使用してください。これは、分離組織25 mgあるいは4×106個の細胞から得られたIP prep 100 μLにおよそ相当します。一般的には、抗体を加える前に、クロマチン調製液100 μLを1×ChIPバッファー400 μLに加えて希釈しますが、1回の免疫沈降につきクロマチン調製液が100 μL以上必要な場合は、下記の希釈を行う必要はありません。希釈しない場合、希釈していないクロマチン調製液に抗体を直接加え、クロマチン複合体の免疫沈降ができます。

実験開始前の準備:

  • 200×PICを室温に戻してください。PICが完全に溶けていることを確認してください。
  • 10×ChIPバッファーを室温に戻してください。SDSが完全に溶解していることを確認してください。
  • 断片化されたクロマチン調製液 (Section IIIのステップ9.) を溶かして、氷上に置いてください。
  • Low salt wash: 免疫沈降1回分として1×ChIPバッファー3 mL (10×ChIPバッファー300 μL + 水2.7 mL) を用意して、使用するまで室温で保存してください。
  • High salt wash: 免疫沈降1回分として1×ChIPバッファー1 mL (10×ChIPバッファー100 μL + 水900 μL) + 5 M NaCl 70 μLを用意して、使用するまで室温で保存してください。
  1. 1本のチューブに、免疫沈降の予定回数分に十分な1×ChIPバッファーを用意してください。免疫沈降1回分として、1×ChIPバッファー400 μL (10×ChIPバッファー40 μL + 水360 μL) + 200×PIC 2 μLが必要となります。ポジティブコントロールのHistone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620、およびネガティブコントロールのNormal Rabbit IgG #2729の分も忘れずに用意してください。1×ChIPバッファー + PIC混合液を氷上に置いてください。
  2. 調製した1×ChIPバッファー + PIC混合液に、クロスリンク、断片化されたクロマチン調製液 (Section IIIのステップ9.より) 100 μL (クロマチン5-10 μg) を免疫沈降1回分として加えてください。例えば、免疫沈降10回分の場合には、1×ChIPバッファー4 mL (10×ChIPバッファー400 μL + 水3.6 mL) + 200×PIC 20 μL + クロマチン調製液1 mLを入れたチューブを用意してください。
  3. 希釈したクロマチン調製液10 μLを2%インプットサンプルとして遠心用チューブに分注し、使用するまで-20℃で保存してください (Section VIのステップ1.)。
  4. 各免疫沈降のために、希釈したクロマチン調製液500 μLを1.5 mL遠心用チューブに分注し、免疫沈降用抗体を加えてください。免疫沈降用抗体の必要量は抗体によって異なるため、お客様自身で決定する必要があります。ポジティブコントロールのHistone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620は10 μL、ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgG #2729は1-2 μL (1-2 μg) を免疫沈降サンプルに加えてください。ローテーターを用いて、免疫沈降サンプルを4℃で4時間から一晩インキュベートしてください。

注意: CSTが提供するほとんどの抗体は、1回の免疫沈降サンプル当たり1-2 μgで最適に働きます。複数のサンプルに対し様々な抗体濃度で実験する場合、ネガティブコントロールNormal Rabbit IgG #2729の抗体濃度は、使用する中で最も高い抗体濃度に合わせてください。

  1. ChIP-Grade Protein G磁気ビーズ #9006を穏やかにボルテックスし、再懸濁してください。直ちに30 μLを各免疫沈降反応液に加え、ローテーターを用いて、4℃で2時間インキュベートしてください。
  2. チューブをMagnetic Separation Rack #7017 / #14654にセットし、各免疫沈降反応液のProtein G磁気ビーズを沈澱させてください。溶液が澄むのを1-2分間待ち、上清を注意深く除去してください。
  3. Protein G磁気ビーズにLow salt wash 1 mLを加え、ローテーターを用いて、4℃で5分間インキュベートし、洗浄してください。ステップ6.と7.を更に2回繰り返し、計3回洗浄してください。
  4. Protein G磁気ビーズにHigh salt wash 1 mLを加え、ローテーターを用いて、4℃で5分間インキュベートし、洗浄してください。
  5. チューブをMagnetic Separation Rackにセットし、各免疫沈降反応液のProtein G磁気ビーズを沈澱させてください。溶液が澄むのを1-2分間待ち、上清を注意深く除去してください。直ちにSection VIに進んでください。

VI. 抗体/Protein G磁気ビーズからのクロマチン溶出、および脱クロスリンク:

実験開始前に:

  • 2×ChIP溶出バッファーを37℃のwater bathで温め、SDSが完全に溶解していることを確認してください。
  • water bathまたはサーモミキサーを65℃に設定してください。
  • 各免疫沈降サンプルおよび2%インプットサンプル用に、1×ChIP溶出バッファー150 μL (2×ChIP溶出バッファー75 μL + 水75 μL) を用意してください。
  1. 1×ChIP溶出バッファー150 μLを2%インプットサンプルのチューブに加え、ステップ6.まで室温に置いておきます。
  2. 各免疫沈降サンプルに、1×ChIP溶出バッファー150 μLを加えてください。
  3. 穏やかにボルテックスしながら (1,200 rpm)、65℃で30分間、抗体/Protein G磁気ビーズからクロマチンを溶出してください。本ステップには、サーモミキサーの使用を推奨します。ローテーターを用いて室温で溶出できますが、溶出が完全でない可能性があります。
  4. チューブをMagnetic Separation Rackにセットし、Protein G磁気ビーズを沈澱させて、溶液が澄むのを1-2分間待ってください。
  5. クロマチンが溶出している上清を、注意深く新しいチューブに移してください。
  6. ステップ1.の2%インプットサンプルチューブを含む、すべてのチューブに、5 M NaCl 6 μL、Proteinase K 2 μLを加え、65℃で2時間インキュベートし、脱クロスリンクしてください。一晩インキュベートしても構いません。
  7. 直ちにSection VIIへ進んでください。サンプルは-20℃で保存できますが、沈降物の生成を防ぐために、DNA Binding Bufferを加える (Section VIIのステップ1.) 前に必ず室温に戻してください。

VII. スピンカラムを用いたDNAの精製:

実験開始前に:

  • 使用前のDNA Wash Bufferにエタノール (96-100%) 24 mLを加えてください。本ステップは、初回のみ行ってください。
  • 各DNAサンプル (Section VIより) に対し、DNA精製回収チューブをひとつずつ用意してください。
  1. DNA Binding Buffer 750 μLを各DNAサンプル150 μLに加えて、軽くボルテックスしてください。
    • サンプルに対して、5倍量のDNA Binding Bufferを使用します。
  2. ステップ1.の各サンプル450 μLを、回収チューブに設置したDNAスピンカラムに移してください。
  3. 14,000 rpmで30秒間遠心してください。
  4. 回収チューブからDNAスピンカラムを取り外し、液体を捨て、DNAスピンカラムを回収チューブに再設置してください。
  5. ステップ1.で残った各サンプル450 μLを、回収チューブに設置したDNAスピンカラムに移し、ステップ3.と4.を繰り返してください。
  6. 回収チューブに設置したDNAスピンカラムにDNA Wash Buffer 750 μLを加えてください。
  7. 14,000 rpmで30秒間遠心してください。
  8. 回収チューブからDNAスピンカラムを取り外し、液体を捨て、DNAスピンカラムを回収チューブに再設置してください。
  9. 14,000 rpmで30秒間遠心してください。
  10. DNAスピンカラムを取り外し、回収チューブと液体を捨ててください。スピンカラムは捨てないでください。
  11. DNAスピンカラムを1.5 mL遠心用チューブに設置し、DNA Elution Buffer 50 μLを加えてください。
  12. 14,000 rpmで30秒間遠心し、DNAを溶出してください。
  13. DNAスピンカラムを取り外し、捨ててください。精製したDNAの溶出液は、-20℃で保存してください。

VIII. PCRによるDNAの定量化:

推奨:

  • 汚染の危険性を最小化するために、フィルター入りチップを使用してください。
  • キットに含まれているコントロールプライマーは、ヒトまたはマウスのRPL30遺伝子 (#7014#7015) に特異的であり、通常のPCRまたはリアルタイム定量PCRのどちらでも使用できます。ヒトやマウス以外の種でChIPを行っている場合は、別途、DNAに特異的なプライマーを設計し、PCRの最適条件を決定してください。
  • 非特異的なPCR産物の形成を最小化するために、ホットスタート用Taqポリメラーゼの使用を推奨します。
  • プライマー選択は非常に重要です。以下の条件に近いプライマーを設計してください:
プライマーの長さ: 24塩基
Tm: 60°C
GC: 50%
アンプリコンのサイズ: 150-200 bp (通常のPCR)
80-160 bp (リアルタイム定量PCR)

通常のPCR:

  1. 0.2 mL PCRチューブにサンプル番号をラベルしてください。その際、2%インプットサンプル、ポジティブコントロール用Histone H3サンプル、ネガティブコントロール用Normal Rabbit IgGサンプル、およびDNA汚染確認用のコントロールとしてDNAを含まないチューブも用意してください。
  2. 各PCRチューブにDNAサンプルを2 μLずつ加えてください。
  3. 分量不足を防ぐために、実際のチューブの本数に2本追加した量を全体量として、マスターミックスを下記の通りに用意してください。各PCRチューブにマスターミックス18 μLを加えてください。
試薬 PCR反応液1本分の量 (18 μL)
Nuclease-free H2O 12.5 μL
10×PCRバッファー 2.0 μL
4 mM dNTPミックス 1.0 μL
5 μM RPL30プライマー 2.0 μL
Taq DNAポリメラーゼ 0.5 μL
  1. 以下のプログラムでPCRを開始してください:
a. 初期変性 95°C 5分間
b. 変性 95°C 30秒間
c. アニーリング 62°C 30秒間
d. 伸長反応 72°C 30秒間
e. ステップb.-d.を繰り返し、計34サイクル反応させてください
f. 最終伸長 72°C 5分間
  1. 反応終了後、100 bp DNAマーカーとともに、各PCR産物10 μLを2%アガロースゲルまたは10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動してください。期待されるPCR産物のサイズは、ヒトRPL30 #7014の場合は161 bp、マウスRPL30 #7015の場合は159 bpです。

リアルタイム定量PCR:

  1. 使用するPCR機のモデルに適合するPCRチューブまたはPCRプレートをラベルしてください。その際、ポジティブコントロール用Histone H3サンプル、ネガティブコントロール用Normal Rabbit IgGサンプル、DNA汚染確認用のコントロールとしてDNAを含まないチューブ、および標準曲線作成と増幅効率決定用として2%インプットクロマチンDNAの連続希釈試料 (希釈なし、1:5、1:25、1:125) も用意してください。
  2. 各PCRチューブまたはPCRプレートの各ウェルに、DNAサンプルを2 μLずつ加えてください。
  3. 分量不足を防ぐために、実際のチューブの本数に2本追加した量を全体量として、マスターミックスを下記の通りに用意してください。各PCRチューブまたは各ウェルにマスターミックス18 μLを加えてください。
試薬 PCR反応液1本分の量 (18 μL)
Nuclease-free H2O 6 μL
5 μM RPL30プライマー 2 μL
SYBR®-Green Reaction Mix 10 μL
  1. 以下のプログラムでPCRを開始してください:
a. 初期変性 95°C 3分間
b. 変性 95°C 15秒間
c. アニーリング/伸長: 60°C 60秒間
d. ステップb.とc.を繰り返し、計40サイクル反応させてください
  1. リアルタイムPCR機に付属のソフトウェアで定量結果を解析してください。または、下記公式を用いてIP効率を算出できます。Percent Inputは、インプットクロマチン量に対する各IPで得られたクロマチン量の割合を示します。

Percent Input = 2% × 2(C[T] 2% Input Sample – C[T] IP Sample)

C[T] = CT = Threshold cycle of PCR reaction

IX. 次世代シークエンスライブラリー構築:

このキットで調製されたChIP産物のDNAサンプルは、直接ChIP-seqに使用できます。次世代シークエンスDNAライブラリーの構築は、採用予定のシークエンスプラットフォームと互換性のあるDNAライブラリー調製プロトコールまたはキットを使用して行ってください。Illumina®プラットフォームでのシークエンスには、NEBNext® Ultra II Library Prep Kit for Illumina® (New England Biolabs; Cat #E7645S/L) の使用をお勧めします。

推奨:

  • 転写因子または転写補助因子のChIP-seqには、少なくとも5 ngのChIP産物のDNAを使用し、10サイクルのPCRでアダプター配列が結合したDNAを増幅してください。
  • 総ヒストンおよびヒストン修飾のChIP-seqには、またはインプットサンプルについては、50 ngのDNAを使用し、6サイクルのPCRでアダプター配列が結合したDNAを増幅してください。
  • ChIP産物のDNAのライブラリー構築には、どんなターゲットタイプにおいてもサイズセレクションを行わずに、アダプター配列が結合したDNAをクリーンアップしてください。
  • DNAライブラリー構築後、Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies; Cat #G2938-90322)を用いて、または50〜100 ngのDNAを2%アガロースゲル電気泳動することにより、アダプターダイマー(〜140 bp)が存在するかどうかを確認してください。アダプターダイマーがDNAライブラリーに存在する場合は、PCR増幅産物のクリーンアップを繰り返してください。
  • ライブラリーの品質は、既知のポジティブおよびネガティブコントロール用プライマーセットを用いたリアルタイムPCRにより確認することもできます。オリジナルのChIP産物を用いた結果と同様に、DNAライブラリーでもポジティブコントロールはネガティブコントロールと比較して高いシグナルが得られるはずです。
  • 最終的なクリーンアップおよび品質チェックの後、最終精製ライブラリーサンプルを2〜10 nMに調製して次世代シークエンスに使用してください。

APPENDIX A: 予想されるクロマチン産生量

組織サンプルからクロスリンクされたクロマチンを採取する場合、クロマチンの産生量は組織タイプによってかなり異なります。下記テーブルに、各組織25 mg (一番下のHeLa細胞は4×106個) から得られると予想されるクロマチン産生量と予想されるDNA濃度 (Section IVのプロトコールで測定) を掲載しました。各組織タイプにおいて、Medimachine (BD Biosciences) とDounce Homogenizerを用いた分離方法でクロマチン産生量に大きな違いはありませんでした。しかし、組織分離にMedimachineを用いた場合、Dounce Homogenizerに比べてIP効率が高くなりました。脳組織の場合、Medimachineでは適切に単細胞懸濁液に分離できないので、Dounce Homogenizerでの分離を強くお薦めします。最適なChIPの結果を得るために、5-10 μgのクロスリンク、断片化されたクロマチンを各免疫沈降に使用することをお薦めします。従って、組織によっては各免疫沈降に25 mg以上必要になる場合があります。

組織/細胞 総クロマチン産生量 予想されるDNA濃度
脾臓 組織25 mgにつき20-30 μg 200-300 μg/mL
肝臓 組織25 mgにつき10-15 μg 100-150 μg/mL
腎臓 組織25 mgにつき8-10 μg 80-100 μg/mL
組織25 mgにつき2-5 μg 20-50 μg/mL
心臓 組織25 mgにつき2-5 μg 20-50 μg/mL
HeLa 4×106細胞につき10-15 μg 100-150 μg/mL

APPENDIX B: クロマチン断片化の最適化

クロスリンクされたクロマチンDNAを150-900 bpの長さに断片化するための最適条件は、使用する組織や細胞の量に対するMicrococcal Nucleaseの量に大きく依存します。下記は、特定の組織や細胞タイプでクロマチン断片化の最適条件を決定するためのプロトコールです。

  1. Section I、II、IIIに従い、組織125 mgあるいは2×107個の細胞 (5 IP prep分) を用いてクロスリンクされた細胞核を調製してください。Section IIIのステップ2.を行った後、下記に進んでください。
  2. 細胞核調製液100 μLを1.5 mL遠心用チューブ5本に分注し、氷上に置いてください。
  3. Micrococcal Nuclease原液3 μLを1×バッファーB + DTT混合液27 μLに加えてください (酵素を10倍に希釈します)。
  4. ステップ2.の各チューブに、希釈したMicrococcal Nuclease 0 μL、2.5 μL、5 μL、7.5 μL、10 μLを加え、チューブを数回転倒混合し、37℃でよく混ぜ合わせながら、20分間インキュベートしてください。
  5. 0.5 M EDTA 10 μLを加えることで断片化を終了し、チューブを氷上に置いてください。
  6. 13,000 rpm、4℃で1分間遠心して細胞核を沈澱させ、上清を除去してください。
  7. 細胞核ペレットを1×ChIPバッファー + PIC混合液200 μLに再懸濁し、氷上で10分間インキュベートしてください。
  8. 溶解物を数回超音波処理し、核膜を破砕してください。超音波処理の合間は、サンプルを氷上で30秒間インキュベートしてください。細胞核を完全に溶解するための最適条件は、超音波処理の前後に光学顕微鏡でサンプルを観察することで決定できます。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicatorを6に設定し (1/8-inch probe)、20秒間の超音波処理を3回行うことで、HeLa細胞核は完全に溶解されます。Dounce homogenizerで20回処理を行っても細胞核は溶解されますが、完全な溶解でない可能性があります。
  9. 10,000 rpm、4℃で10分間遠心し、溶解物を浄化してください。
  10. 超音波処理した各溶解物50 μLを新しい遠心用チューブに移してください。
  11. 各サンプル50 μLに、nuclease-free water 100 μL、5 M NaCl 6 μL、RNase A 2 μLを加えてください。ボルテックスして、37℃で30分間インキュベートしてください。
  12. RNase Aで処理した各サンプルに、Proteinase K 2 μLを加えてください。ボルテックスして、65℃で2時間インキュベートしてください。
  13. 100 bp DNAマーカーとともに、各サンプル20 μLを1%アガロースゲルで電気泳動し、DNAフラグメントサイズを測定してください。
  14. DNAサイズ150-900 bpが得られた断片化の条件を確認してください (ヌクレオソーム1-6個)。本プロトコールによる目的サイズのDNAフラグメントを産出した希釈したMicrococcal Nucleaseの量は、目的サイズのDNAフラグメントを得るために1回分の免疫沈降調製液 (分離組織25 mgあるいは4×106個の組織培養細胞) に加えるMicrococcal Nuclease原液量の10倍となっています。例えば、本プロトコールで希釈したMicrococcal Nuclease 5 μLが150-900 bpのDNAフラグメントを産出したとすると、Section IIIにおいて、0.5 μLのMicrococcal Nuclease原液を免疫沈降1回分の調製液に加えてクロマチンを断片化することになります。
  15. 目的サイズのDNAフラグメントが得られなかった場合は、Micrococcal Nucleaseの量を調整しながら本プロトコールを繰り返してください。または、クロマチン断片化の時間を調整することでDNAフラグメントサイズを最適化することができます。

APPENDIX C: トラブルシューティングガイド

問題 原因 推奨する対応策
1. 断片化されたクロマチンの濃度が極めて低い。 クロマチン断片化の際に、十分な細胞量が加えられていない。または、断片化後、核が完全に溶解されていない。 クロマチン調製液のDNA濃度が低くおよそ50 μg/mLの場合、各IPに少なくとも5 μg/IPになるようにクロマチンを追加してください。
クロスリンクの前に、組織重量またはカウント用に別途用意したプレートの細胞数を計測してください。また、超音波処理の前後に光学顕微鏡で観察し、細胞核が完全に溶解していることを確認してください。
2. クロマチンの断片化が不十分で、フラグメントが大きすぎる (900 bp以上)。 クロスリンクが過剰である。10分間以上のクロスリンク処理は、クロマチンの断片化を阻害する恐れがある。 一定のホルムアルデヒド濃度でクロスリンクを経時的に評価してください。クロスリンク処理の時間を10分間以下に短縮してください。
細胞数が多すぎる。またはMicrococcal Nucleaseの量が足りない。 クロスリンクの前に、組織重量またはカウント用に別途用意したプレートの細胞数を計測してください。次に、Appendix Bに従ってクロマチン断片化の最適化をしてください。
3. クロマチンの断片化が進行しすぎており、フラグメントが小さすぎる (すべてヌクレオソーム1個分に相当する150 bp)。クロマチンがヌクレオソーム1個分のサイズに完全に断片化されると、特に150 bp以上のアンプリコンの定量PCRシグナルを減少させる。 細胞数が少ない。またはMicrococcal Nucleaseの量が多い。 クロスリンクの前に、細胞重量またはカウント用に別途用意したプレートの細胞数を計測し、組織や細胞を増やしてください。次に、Appendix Bに従ってクロマチン断片化の最適化をしてください。
4. インプットサンプルでPCR産物が得られない、または非常に僅かである。 PCR反応液に十分なDNAが加えられていない。または、PCR条件が最適でない。 PCR反応液にDNAを追加してください。または、PCRサイクル数を増やしてください。
PCR増幅領域がヌクレオソーム・フリー領域に渡っている。 クロスリンク、断片化されたクロマチンから精製したDNAを用いて、PCR条件をプライマーに対して最適化してください。
異なるプライマーを設計し、アンプリコンの長さが150 bp以下になるようにしてください (Section VIIIのプライマー設計に対する推奨を参照のこと)。
IPに十分なクロマチンが加えられていない。または、クロマチンの断片化が進行しすぎている。 最適なChIPの結果を得るために、各IPに5-10 μgのクロマチンを加えてください。上記1.と3.も参照してください。
5. ポジティブコントロールのHiston H3-IP RPL30のPCR産物が得られない。 IP反応液に十分なクロマチンまたは抗体が加えられていない。または、IPの反応時間が短すぎる。 各IP反応液に、少なくともクロマチン5-10 μg、抗体10 μLを加え、一晩インキュベートした後、Protein Gビーズを加え、更に2時間インキュベートしてください。
Protein Gビーズからのクロマチン溶出が不完全である。 ビーズの懸濁状態を保つよう頻繁に撹拌しながら、65℃でProtein Gビーズからクロマチンを溶出してください。
6. ネガティブコントロールのRabbit IgG-IPとポジティブコントロールのHistone H3-IPのPCR産物が同量になる。 IP反応液にクロマチンを加えすぎている、または不十分である。あるいは、抗体を加えすぎている。 クロマチン15 μg、Histone H3 抗体10 μLを上限で各IP反応液に加えてください。Normal Rabbit IgGの量を1 μL/IPに減らしてください。
PCR反応液にDNAを加えすぎている。または、PCRサイクル数が多すぎる。 PCR反応液に加えるDNAを少なくするか、PCRサイクル数を減らしてください。線形増幅領域でPCR産物の解析を行わないと、希釈系列を作成しても、濃度依存性を正確に調べることができません。
7. 抗体-IPのPCR産物が得られない。 PCR反応液にDNAが十分に加えられていない。 PCR反応液にDNAを追加するか、PCRサイクル数を増やしてください。
IP反応液に抗体が十分に加えられていない。 通常、IP反応液に1-5 μgの抗体を加えますが、実際に必要な量は抗体によって大きく異なります。IPに加える抗体の量を増やしてください。
ChIPに不適切な抗体である。 別の抗体を検討してください。

posted December 2011

revised January 2016

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