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磁気ビーズでの免疫沈降 プロトコール (非変性タンパク質) (IP / Native Protein)

#12302 Phospho-Chk1 (Ser317) (D12H3) XP® Rabbit mAb用プロトコール

このプロトコールは、ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイによる解析用に非変性タンパク質を磁気ビーズで免疫沈降する際にご使用いただけます。

A. 溶液および試薬

注意: 溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS): (#9808) 1×PBSを1 L用意する場合は、20×PBS 50 mLを精製水950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10X Cell Lysis Buffer: (#9803) 1X Cell Lysis Buffer10 mL用意する場合は、10×細胞溶解バッファー1 mLを精製水9 mLに加え、混ぜ合わせてください。

    注意: 使用直前に1 mM PMSF (#8553) を添加してください。

  3. 3X SDS Sample Buffer: (Blue Loading Pack (#7722) または Red Loading Pack (#7723)) 3X SDS Loading Bufferに1/10容量の30X DTTを加え、新しい3X Reducing Loading Bufferを用意してください。
  4. Protein A Magnetic Beads: ラビットIgGの免疫沈降にはProtein A (#73778) を使用してください。
  5. Magnetic Separation Rack: (#7017) または (#14654).
  6. 10X Kinase Buffer (for kinase assays): (#9802) 1X Kinase Bufferを1 mL用意する場合は、10X Kinase Buffer 100 µLを精製水900 µLに加え、混ぜ合わせてください。
  7. ATP (10 mM) (for kinase assays): (#9804) 200 µM ATPを0.5 mL用意する場合は、10 mM ATP 10 µLを1X Kinase Buffer 490 µLに加えてください。

B. 細胞溶解物の調製

  1. 培地を吸引除去し、調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
  2. 非変性状態で細胞を回収するために、培地を除去し、氷冷した1×PBSで細胞を1回すすいでください。
  3. PBSを除去し、各プレート (10 cm) に氷冷した1×細胞溶解バッファー0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. プレートから細胞をこすり落とし、遠心用チューブに移して氷上に置いてください。
  5. 氷上で各5秒間、3回超音波処理してください。
  6. 14,000xg、4°Cで10分間遠心し、新しいチューブに上清を移してください。上清が細胞溶解物です。必要に応じて、溶解物は-80°Cで保存できます。

C. 免疫沈降

細胞溶解物の前洗浄 (オプション)

Protein A Magnetic Beadsへのタンパク質の非特異的な結合を減らすために、細胞溶解物の前洗浄をお勧めいたします。試験サンプルとアイソタイプコントロール用に十分な量の溶解物を前洗浄してください。

  1. Magnetic Beadsのストックチューブを緩やかなボルテックスにより懸濁してください。

    重要: #73778 Magnetic Beadsの前洗浄は使用直前に行ってください。

  2. ビーズ懸濁液 20 µLを新しいチューブに加えてください。チューブをMagnetic Separation Rackに10-15秒置いてください。

    溶液が澄んだら上清を慎重に除去してください。沈殿物に1X cell lysis buffer 500 µLを加え、緩やかにボルテックスして洗浄してください。チューブをMagnetic Separation Rackに戻してください。溶液が澄んだら上清を慎重に除去してください。洗浄ステップをもう1回繰り返してください。

  3. 細胞溶解物200 µLに前洗浄したMagnetic Beads 20 µLを加えてください。

    重要: 細胞溶解物の最適なタンパク質濃度は目的とするタンパク質の発現量によって異なります。250 µg/mL-1.0 mg/mLから検討を始めることをお勧めします。

  4. 室温で20分間、ローテーションしながらインキュベートしてください。
  5. Magnetic Separation Rackを用いてビーズから溶解物を分離し、前洗浄した溶解物を新しいチューブに移してください。
  6. 免疫沈降セクションに進んでください。

免疫沈降

重要: 免疫沈降に使用した一次抗体が特異的かどうかを確認するため、適切なアイソタイプコントロールを組み入れることをお勧めします。ラビットポリクローナル抗体に対してはNormal Rabbit IgG #2729、ラビットモノクローナル抗体に対してはRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900、マウスモノクローナル抗体に対してはMouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415をお使いください。アイソタイプコントロールは一次抗体サンプルと濃度を揃え、同時に反応させる必要があります。

  1. 細胞溶解物200 µLに一次抗体 (データシート記載の推奨希釈率) を加え、4°Cで一晩、ローテーションしながらインキュベーションして免疫複合体を形成させてください。
  2. Magnetic Beadsを前洗浄してください (細胞溶解物の前洗浄セクションのステップ1, 2を参照)。
  3. 溶解物と抗体 (免疫複合体) の溶液を前洗浄したMagnetic Beadsを含むチューブに移してください。
  4. 室温で20分間、ローテーションしながらインキュベートしてください。
  5. Magnetic Separation Rackを用いてビーズを沈殿させてください。1X Cell Lysis Buffer 500 μLで5回洗浄してください。洗浄中はサンプルを氷上に置いてください。
  6. ウェスタンブロッティングまたはキナーゼアッセイに進んでください (セクションD)。

D. サンプルの解析

次の各ステップのうち、適切なステップに進んでください。

ウェスタンブロッティングによる解析の場合

  1. 沈殿物を3X SDS sample buffer 20-40 µLに懸濁し、軽くボルテックスした後、軽く遠心して沈殿させてください。
  2. サンプルを95-100°Cで5分間加熱処理してください。
  3. Magnetic Separation Rackを使ってビーズを沈殿させてください。上清を新しいチューブに移してください。上清がサンプルです。
  4. ウェスタンブロッティングでサンプルを解析してください (ウェスタンブロッティングのプロトコールを参照してください)。

注意: 変性したIgG重鎖によるマスキングを最小限にするために (~50 kDa)、二次抗体にはMouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262)、あるいはMouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (もしくはHRP conjugate #5127)の使用をお勧めします。変性したIgG軽鎖によるマスキングを最小限にするために (~25 kDa)、Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (もしくはHRP conjugate #5127)の使用をお勧めします。

キナーゼアッセイによる解析の場合

  1. 沈殿物を1X Kinase Buffer 500 µLで2回洗浄してください。洗浄は氷上で行ってください。
  2. 沈殿物を200 μM ATPと基質を添加した1×キナーゼバッファー40 μLに懸濁してください。
  3. 30°Cで30分間インキュベートしてください。
  4. 3X SDS Sample Buffer 20 µLで反応を停止し、ボルテックスした後、30秒間遠心してください。
  5. リン酸化基質を含む上清を新しいチューブに移してください。
  6. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱処理し、14,000xgで1分間加熱してください。
  7. SDS-PAGEゲルでサンプル (15-30 µL)を電気泳動してください。

posted December 2008

revised October 2017

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