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免疫沈降 プロトコール (非変性タンパク質) (IP / Native Protein)

#13917 CD45 (D9M8I) XP® Rabbit mAb用プロトコール

このプロトコールは、ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイによる解析用に非変性タンパク質を免疫沈降する際にご使用いただけます。

A. 溶液および試薬

注意: 溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20×PBS: (#9808) 1×PBSを1 L用意する場合は、20×PBS 50 mLを精製水950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10×細胞溶解バッファー: (#9803) 1×細胞溶解バッファーを10 mL用意する場合は、10×細胞溶解バッファー1 mLを精製水9 mLに加え、混ぜ合わせてください。

    注意: 使用直前に1 mM PMSF (#8553) を添加してください。

  3. 3×SDSサンプルバッファー: (Blue Loading Pack #7722またはRed Loading Pack #7723) 3×SDS泳動バッファーに1/10容量の30×DTTを加え、新鮮な3×還元用泳動バッファーを用意してください。
  4. Protein Aアガロースビーズ: ラビットIgGの免疫沈降にはProtein A (#9863) を使用してください。
  5. 10×キナーゼバッファー (キナーゼアッセイ用): (#9802) 1×キナーゼバッファーを1 mL用意する場合は、10×キナーゼバッファー100 μLを精製水900 μLに加え、混ぜ合わせてください。
  6. ATP (10 mM) (キナーゼアッセイ用): (#9804) 200 μM ATPを0.5 mL用意する場合は、10 mM ATP 10 μLを1×キナーゼバッファー490 μLに加えてください。

B. 細胞溶解物の調製

  1. 培地を吸引除去し、調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
  2. 非変性状態で細胞を回収するために、培地を除去し、氷冷した1×PBSで細胞を1回すすいでください。
  3. PBSを除去し、各プレート (10 cm) に氷冷した1×細胞溶解バッファー0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. プレートから細胞をこすり落とし、遠心用チューブに移して氷上に置いてください。
  5. 氷上で各5秒間、3回超音波処理してください。
  6. 14,000×g、4℃で10分間遠心し、新しいチューブに上清を移してください。上清が細胞溶解物です。必要に応じて、溶解物は-80℃で保存できます。

C. 免疫沈降

細胞溶解物の前洗浄 (オプション)

  1. 緩やかにボルテックスし、1 mg/mLの細胞溶解物200 μLにProtein Aアガロースビーズ (50%ビーズ懸濁液) 10-30 μLを加えてください。
  2. 緩やかに振盪しながら4℃で30-60分間インキュベートしてください。
  3. 4℃で10分間遠心し、上清を新しいチューブに移してください。
  4. 下記の免疫沈降の操作に進んでください。

免疫沈降

  1. 1 mg/mLの細胞溶解物200 μLに一次抗体を加え (一次抗体の希釈率は、製品のデータシートを参照してください)、緩やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. Protein Aアガロースビーズ (50%ビーズ懸濁液10-30 μL) を加え、緩やかに振盪しながら4℃で1-3時間インキュベートしてください。
  3. 4℃で30秒間遠心し、沈殿物を1×細胞溶解バッファー500 μLで5回洗浄してください。洗浄は氷上で行ってください。
  4. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイで沈殿物を解析してください (D. サンプルの解析)。

D. サンプルの解析

適切な操作に進んでください。

ウェスタンブロッティングによる解析の場合

  1. 沈殿物を3×SDSサンプルバッファー20 μLに再懸濁し、ボルテックスした後、14,000×gで30秒間遠心してください。
  2. サンプルを95-100℃で2-5分間加熱処理し、14,000×gで1分間遠心してください。
  3. SDS-PAGEゲル (4-20%) でサンプル (15-30 μL) を電気泳動してください。
  4. ウェスタンブロッティングでサンプルを解析してください (ウェスタンブロッティングのプロトコールを参照してください)。

注意: 分子量が50 kDa付近のタンパク質の場合、変性したIgG重鎖によるマスキングを最小限にするために、二次抗体にはMouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677)、あるいはMouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (もしくはHRP conjugate #5127) の使用をお薦めします。分子量が25 kDa付近のタンパク質の場合、変性したIgG軽鎖によるマスキングを最小限にするために、Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (もしくはHRP conjugate #5127) をお薦めします。

キナーゼアッセイによる解析の場合

  1. 沈殿物を1×キナーゼバッファー500 μLで2回洗浄してください。洗浄は氷上で行ってください。
  2. 沈殿物を200 μM ATPと基質を添加した1×キナーゼバッファー40 μLに懸濁してください。
  3. 30℃で30分間インキュベートしてください。
  4. 3×SDSサンプルバッファー20 μLで反応を停止し、ボルテックスした後、30秒間遠心してください。
  5. リン酸化基質を含む上清を新しいチューブに移してください。
  6. サンプルを95-100℃で2-5分間加熱処理し、14,000×gで1分間遠心してください。
  7. SDS-PAGEゲル (4-20%) でサンプル (15-30 μL) を電気泳動してください。

posted December 2008

revised November 2013

protocol id: 409

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