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フローサイトメトリー ラビット抗体用プロトコール (メタノール透過化処理)

#4858 Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® Rabbit mAb用プロトコール

A. 溶液および試薬

注意: 溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20×PBS: (#9808) 1×PBSを1 L用意する場合は、20×PBS 50 mLを精製水950 mLに加えて混ぜ合わせてください。
  2. 16%ホルムアルデヒド (メタノール不含).
  3. 100%メタノール
  4. インキュベーションバッファー: BSA 0.5 gを1×PBS 100 mLに溶解してください。4°Cで保存してください。
  5. 推奨二次抗体 (Anti-Rabbit):

B. 固定

注意: 全血サンプルの場合は、固定前に赤血球を溶血して遠心により洗浄してください。

  1. 遠心により細胞を集め、上清を吸引除去してください。
  2. 1×PBS 0.5-1 mLに細胞を再懸濁し、ホルムアルデヒドを最終濃度が4%になるように加えてください。
  3. 室温で15分間固定してください。
  4. 過剰量の1X PBSを加えて遠心して洗浄してください。上清を適当な廃棄容器に捨ててください。細胞を1X PBS 0.5-1 mLで再懸濁してください。

C. 透過化処理

  1. 予冷した細胞に、緩やかにボルテックスしながら氷冷した100%メタノールを最終濃度が90%になるようにゆっくりと加え、細胞を透過化処理してください。
  2. 氷上で30分間冷却してください。
  3. 免疫染色操作 (Section D) に進んでください。染色操作を続けて行わない場合は、細胞を90%メタノールに浸し、–20°Cで保存してください。

D. 免疫染色

注意: 細胞数を血球計あるいはその他の方法で測定してください。

  1. チューブまたはウェルに必要数の細胞を分注してください。
  2. メタノールを除くため、過剰量の1X PBSを加えて遠心して洗浄してください。上清を適当な廃棄容器に捨ててください。必要に応じて洗浄操作を繰り返してください。
  3. インキュベーションバッファーで推奨の希釈率に希釈した一次抗体100 µLに、細胞を再懸濁してください。
  4. 室温で1時間インキュベートしてください。
  5. インキュベーションバッファーを加えて遠心して洗浄してください。上清を適当な廃棄容器に捨ててください。洗浄操作を繰り返してください。
  6. インキュベーションバッファーで推奨の希釈率に希釈した蛍光標識二次抗体100 µLに、細胞を再懸濁してください。
  7. 室温で30分間インキュベートしてください。
  8. インキュベーションバッファーを加えて遠心して洗浄してください。上清を適当な廃棄容器に捨ててください。洗浄操作を繰り返してください。
  9. 細胞を1X PBSに再懸濁し、フローサイトメーターで分析してください。DNA染色をする場合は、DNA染色操作 (Section E) に進んでください。

E. DNA染色 (オプション)

  1. DNA dye (#4087 Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solutionなど) 0.5 mLに細胞を再懸濁してください。
  2. 室温で最低5分間インキュベートしてください。
  3. フローサイトメーターで分析してください。

posted July 2009

revised June 2017

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