CST logo

免疫組織染色 (IHC) プロトコール (パラフィン)

#9316 Phospho-GSK-3α (Ser21) (36E9) Rabbit mAb用プロトコール

A. 溶液および試薬

注意: 溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. キシレン
  2. エタノール: 無水変性、病理学グレード (100%および95%).
  3. 精製水
  4. ヘマトキシリン (任意)
  5. 洗浄バッファー: 1×TBST; 1 L用意する場合は、10×TBST (#9997) 100 mLを精製水900 mLに加えて混ぜ合わせてください。
  6. 抗原賦活化用クエン酸: 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー; 1 L用意する場合は、クエン酸ナトリウム二水和物 (C6H5Na3O7•2H2O) 2.94 gを精製水に溶解し、pH 6.0に調整後、全量を1 Lにしてください。
  7. 3%過酸化水素: 100 mL用意する場合は、30% H2O2 10 mLを精製水90 mLに加えてください。
  8. ブロッキング液: 5%正常ヤギ血清含有TBST; 1×TBST 5 mLに正常ヤギ血清250 μLを加えてください。
  9. 検出システム: VECTASTAIN® Elite ABC (Vector Laboratories社製); ビオチン化二次抗体を含みます。
  10. 基質: Vector® NovaRED™ (Vector Laboratories社製).

B. 脱パラフィン/再水和

注意: 操作の間、常にスライドを乾かさないでください。

  1. 切片の脱パラフィン/水和:
    1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
    3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  2. 精製水で切片を各5分間、2回洗浄してください。

C. 抗原賦活化

  1. 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) 中でスライドを沸騰させた後、沸騰直前の温度を10分間維持してください。実験台上でスライドを30分間冷却してください。

D. 染色

  1. 精製水で切片を各5分間、3回洗浄してください。
  2. 3%過酸化水素で切片を10分間インキュベートしてください。
  3. 精製水で切片を各5分間、2回洗浄してください。
  4. 洗浄バッファーで切片を5分間洗浄してください。
  5. ブロッキング液100-400 μLで各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
  6. ブロッキング液を除去し、ブロッキング液でデータシートに記載の通りに希釈した一次抗体100-400 μLを各切片に添加し、4℃で一晩インキュベートしてください。
  7. メーカーの取扱説明書に従って、ABC溶液を調製してください。
  8. 一次抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
  9. メーカーの取扱説明書で推奨される希釈率にTBSTで希釈したビオチン化二次抗体100-400 μLを各切片に添加し、室温で30分間インキュベートしてください。
  10. 二次抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
  11. 切片を覆うように、予め調製したABC溶液100-400 μLを添加してください。加湿チャンバー内で、室温で30分間インキュベートしてください。
  12. 洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
  13. メーカーの取扱説明書に従って、Vector® NovaRED™を調製してください。
  14. 基質100–400 μLを各切片に添加し、注意深く観察してください。通常は5–15分間で十分な染色が得られます。
  15. 必要に応じて、メーカーの取扱説明書に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
  16. 精製水で切片を各5分間、2回洗浄してください。
  17. 切片を脱水してください:
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
  18. 切片をカバーガラスで覆ってください。

posted June 2005

revised February 2008

protocol id: 310

テクニカルサポート

Pathways & Diagrams for Epigenetic Regulation