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免疫組織染色 (IHC) プロトコール (パラフィン)

#3289 5-Lipoxygenase (C49G1) Rabbit mAb用プロトコール

A. 溶液および試薬

注意: 溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. キシレン
  2. エタノール: 無水変性、病理学グレード (100%および95%).
  3. 精製水
  4. ヘマトキシリン (任意)
  5. 洗浄バッファー: 1×TBST; 1 L用意する場合は、10×TBST (#9997) 100 mLを精製水900 mLに加えて混ぜ合わせてください。
  6. SignalStain®抗体希釈液: (#8112).
  7. 抗原賦活化用クエン酸: 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー; 1 L用意する場合は、クエン酸ナトリウム二水和物 (C6H5Na3O7•2H2O) 2.94 gを精製水に溶解し、pH 6.0に調整後、全量を1 Lにしてください。
  8. 3%過酸化水素: 100 mL用意する場合は、30% H2O2 10 mLを精製水90 mLに加えてください。
  9. ブロッキング液: 5%正常ヤギ血清含有TBST; 1×TBST 5 mLに正常ヤギ血清250 μLを加えてください。
  10. 検出システム: SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRPラビット#8114).
  11. 基質: Vector® NovaRED™ (Vector Laboratories社製).

B. 脱パラフィン/再水和

注意: 操作の間、常にスライドを乾かさないでください。

  1. 切片の脱パラフィン/水和:
    1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
    3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  2. 精製水で切片を各5分間、2回洗浄してください。

C. 抗原賦活化

  1. 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) 中でスライドを沸騰させた後、沸騰直前の温度を10分間維持してください。実験台上でスライドを30分間冷却してください。

D. 染色

  1. 精製水で切片を各5分間、3回洗浄してください。
  2. 3%過酸化水素で切片を10分間インキュベートしてください。
  3. 精製水で切片を各5分間、2回洗浄してください。
  4. 洗浄バッファーで切片を5分間洗浄してください。
  5. ブロッキング液100-400 μLで各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
  6. ブロッキング液を除去し、SignalStain®抗体希釈液 (#8112) でデータシートに記載の通りに希釈した一次抗体100-400 μLを各切片に添加し、4℃で一晩インキュベートしてください。
  7. SignalStain® Boost IHC Detection Reagentを室温に戻してください。
  8. 一次抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
  9. 切片を覆うようにSignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRPラビット#8114) を滴下 (1-3滴) してください。加湿チャンバー内で、室温で30分間インキュベートしてください。
  10. 洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
  11. メーカーの取扱説明書に従って、Vector® NovaRED™を調製してください。
  12. 基質100–400 μLを各切片に添加し、注意深く観察してください。通常は5–15分間で十分な染色が得られます。
  13. 必要に応じて、メーカーの取扱説明書に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
  14. 精製水で切片を各5分間、2回洗浄してください。
  15. 切片を脱水してください:
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
  16. 切片をカバーガラスで覆ってください。

posted February 2010

revised November 2013

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